作业帮请问土壤的木聚糖酶活性具体怎么测?
来源：学生作业帮助网 编辑：作业帮 时间：2024/11/15 21:02:24
请问土壤的木聚糖酶活性具体怎么测?
请问土壤的木聚糖酶活性具体怎么测?
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木聚糖酶活性测定方法
（规范性附录）
A 1 方法原理
样品的木聚糖酶对底物——燕麦木聚糖进行水解,用DNS（3,5－二硝基水杨酸）试剂分光光度法测定水解所产生的还原糖量.
A 2 活性单位定义
在温度为50℃,pH 5.3条件下,1s内从燕麦木聚糖中产生1nmol木糖所需的酶量,为1个木聚糖酶的活性单位（BXU）.
A 3 应用范围
本法用于来源于曲霉属（Aspergilious）或木霉属（Trichoderma）的木聚糖酶样品的测定.当分析其它来源的酶时,该法的线性需要校正.本法适用于各种含有木聚糖酶的产品.
A 4 测定条件
A 4.1 底物：燕麦木聚糖
A 4.2 pH：5.3
A 4.3 温度：50℃±0.5℃
A 4.4 保温时间：5min
A 5 仪 器
A 5.1 超级恒温水浴锅：50℃
A 5.2 水浴锅：100℃
A 5.3 旋涡磁力搅拌器
A 5.4 分光光度计：可在540nm下测定吸光度
A 5.5 分析天平：感量0.0001g
A 6 试 剂 所有试剂溶液均需用去离子水配制.
A 6.1 柠檬酸缓冲液（0.05mol/l、pH5.3）
溶解10.5g柠檬酸（C6H8O7•H2O）于800ml水中,并用1mol/L氢氧化钠调pH至5.3,（消耗约110ml 1mol/L氢氧化钠）,再用水定容至1000ml.
A 6.2 底物—1%燕麦木聚糖
称取1.0g燕麦木聚糖,溶于80ml 60℃柠檬酸缓冲液中,磁力搅拌加热至沸腾,继续搅拌冷却至室温,加盖缓慢搅拌过夜.用柠檬酸缓冲液定容至100ml.此底物溶液在4℃时最多保存一周,或将底物溶液分成等份在-20℃下冰冻保存,临用前融解,搅拌均匀使用.
A 6.3 DNS试剂
溶解50.0g 3,5二硝基水杨酸于4000ml水中,不断磁力搅拌,缓缓加入80.0g氢氧化钠,使之完全溶解,在继续磁力搅拌下,将1500g酒石酸钾钠分数次少量加入,并小心加热,溶液最高温度不超过45℃.冷却至室温后定容至5000ml.如溶液不澄清,用Wheatman1号滤纸过滤,然后室温保存于深色瓶中.
A 7 样品制备
精确称取样品1.0000g,置于研钵内,加入5ml的柠檬酸缓冲液,研磨片刻,放置30min后,用柠檬酸缓冲液稀释受检样品.调整稀释倍数使测定时产生的吸光度在0.10～0.40之间.
A 8 测定步骤
A 8.1 试样测定
分别向2支试管加入1.8ml底物溶液,置50℃水浴保温5min.在其中1支试管中加入200μl稀释酶样,磁力旋转搅拌均匀,置50℃水浴中,准确保温5min.分别加入3.0ml DNS试剂至2支试管中,搅拌均匀.在另一试管（空白管）中加入200μl缓冲液.同时将2支试管置入沸水浴准确保温5min,取出置入冷水中冷却至室温.在540nm处测量酶样对空白的吸光度,在酶活标准曲线上读取酶活,再乘以酶样稀释倍数.继续做2个重复测定.
A 8.2 标准曲线的制定
A 8.2.1 配制10μmol/ml木糖储备液
将150mg木糖溶解于柠檬酸缓冲液中,并用柠檬酸缓冲液定容至100ml.储备液可分成小量在-20℃下冰冻.使用前,融解并混合均匀.
A 8.2.2 配制标准稀释液
用缓冲液稀释储备液配制以下标准稀释液：
稀释比例 木糖(μmol/ml) 酶活(BXU/ml)
1+0 10.0 33.33
1+1 5.0 16.67
1+2 3.33 11.11
1+4 2.0 6.67
A 8.2.3 制备标准曲线
每种标准稀释液做2次重复测定.分别向2支试管中加入1.8ml底物溶液,50℃水浴保温5min.加入3.0mlDNS试剂和200μl标准稀释液,在沸水浴中准确保温5min,冷却后在540nm处测量样品对试剂空白的吸光度.以200μl柠檬酸缓冲液代替标准稀释液配制试剂空白.每批样品制备一次标准曲线.
A 9 测定结果的计算
木聚糖酶活性(BXU/g) = （木糖浓度*1000*稀释倍数）/（样品重量*反应时间300S）