DNA或RNA样品不纯,用紫外分光光度计测定其浓度和纯度的准确性会受到影响,为什么?

DNA或RNA样品不纯,用紫外分光光度计测定其浓度和纯度的准确性会受到影响,为什么?
DNA或RNA样品不纯,用紫外分光光度计测定其浓度和纯度的准确性会受到影响,为什么?

DNA或RNA样品不纯,用紫外分光光度计测定其浓度和纯度的准确性会受到影响,为什么?
分光光度计
分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器.常用于核酸,蛋白定量以及细菌生长浓度的定量.核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能.可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸,单链、双链DNA,以及RNA.核酸在波长 260 nm处有最高吸收峰.吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的,所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质,不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性.但紫外法不能区分DNA和RNA,只能用来鉴定核酸的纯度和含量.
蛋白质由于含有芳香氨基酸,因此也能吸收紫外光.通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处,在260nm处的吸收值公为核酸的十分之一或更低,故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大.RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm与280nm吸收的比值则在1.9左右.当样品中蛋白质含量较高时比值即下降.
分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源,通过系列分光装置,从而产生特定波长的光源,光源透过测试的样品后,部分光源被吸收,计算样品的吸光值,从而转化成样品的浓度.样品的吸光值与样品的浓度成正比.
核酸的定量
DNA和RNA都有吸收紫外光的性质,它们的吸收高峰在260nm波长处,每种核酸的分子构成不一, 因此其换算系数不同.定量不同类型的核酸,事先要选择对应的系数.如：1OD 的吸光值分别相当于50μg / ml 的dsDNA,37μg / ml 的ssDNA, 40μg/ml的RNA,30μg/ml的寡核苷酸.测试后的吸光值经过上述系数的换算,从而得出相应的样品浓度,这些由分光光度计内预设的程序执行,因此,测试前选择正确的程序,测试样品的类型,首先测试空白液,然后再测试样品,注意输入样品稀释倍数.
如何避免吸光值漂移
读数不稳定可能是实验者最头痛的问题.灵敏度越高的仪器, 表现出的吸光值漂移越大.事实上,分光光度计的设计原理和工作原理,允许吸光值在一定范围内变化,即仪器有一定的准确度和精确度.
核酸本身物化性质
溶解核酸的缓冲液的pH 值、离子浓度等
在测试时,离子浓度太高也会导致读数漂移,因此建议使用pH 值一定、离子浓度较低的缓冲液（如TE）可大大稳定读数.核酸的吸光值受pH值和缓冲液离子浓度影响.只有在一定的pH值和低离子浓度的条件下（如10 mM Tris-HCl pH 8.0）,才能得到精确的检测结果.水的pH值不稳定,可能导致检测误差.一些缓冲液在紫外范围内存在自身吸收,为了确保准确测量,请使用与悬浮或洗脱样品时相同的缓冲液.
样品的稀释浓度
同样是不可忽视的因素,由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒,尤其是核酸样品.这些小颗粒的存在干扰测试效果.为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响,要求核酸吸光值至少大于0.1A ,吸光值最好在0.1-1.5 A.在此范围内,颗粒的干扰相对较小,结果稳定.从而意味着样品的浓度不能过低,或者过高（超过光度计的测试范围）.
操作因素
如混合要充分,否则吸光值太低, 甚至出现负值；混合液不能存在气泡,空白液无悬浮物,否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品,否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项.
各波长具体含义及相关问题1. A260nm
是核酸最高吸收峰的吸收波长,最佳测量值的范围为0.1至1.0.如果不在此范围,稀释或浓缩样品,使之在此范围内；如果吸光度小于0.05,检查是否存在操作因素（如移液不准确,样品内有悬浮物等）影响.DNA样品的A260 吸光度值是否>0.1.（请注意,这个值跟仪器无关,核酸的吸光度必需大于0.1,其值才有效和可靠,因为样品中的杂质和颗粒这些不纯物的干扰通常会对光有一定吸收,其值<0.1）；
朗伯－比尔定律：
A 吸光值
I0 入射光强度
I 投射光强度
c 吸光物质的摩尔浓度（mol/L）
d 光通过的液层厚度（cm）
ε 摩尔吸光系数（Lmol-1cm-1）
2. A280nm
是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长,比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA的A260/A280比值为1.8,纯RNA为2.0.如果比值低,表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污染,需要纯化样品.比值=1.5相当于50％蛋白质/DNA溶液
3. A230nm
是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长,比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA和 RNA的A260/A230比值为2.5.若比值小于2.0标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染,需要纯化样品.A230产生负值主要是由于在很低DNA 浓度的溶液中的一些其他成分的干扰所导致的.在下一个测定中,需要降低样品的稀释度,A230的负值会被校正.
4. A320nm或A340nm
为检测溶液样品的浊度和其他干扰因子.该值应该接近0.0.如果不是,标明溶液中有悬浮物,需要纯化样品.纯样品的A320一般是 0.
5. A260/A280和A260/A230
是核酸纯度的指示值,纯度好的DNA,在pH7-8.5 下其比值应该在2.0 或2.5,A260 / A280的比值, 用于评估样品的纯度, 因为蛋白的吸收峰是280 nm. 纯净的样品比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）.如果比值低于1.8 或者2.0,表示存在蛋白质或者酚类物质的影响.
A230是多肽、芳香基团、苯酚和一些碳氢化合物的吸光度,A230表示样品中存在一些污染物,如碳水化合物、多肽、苯酚等,较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0 .A280是蛋白质的吸光度.