作业帮简述转基因微生物制药的基本流程
来源：学生作业帮助网 编辑：作业帮 时间：2024/11/16 01:41:39
简述转基因微生物制药的基本流程
简述转基因微生物制药的基本流程
简述转基因微生物制药的基本流程
第一步：目的基因的获取
1.目的基因是指：编码蛋白质的结构基因 .
2.原核基因采取直接分离获得,真核基因是人工合成.人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_.
3.PCR技术扩增目的基因
（1）原理：DNA双链复制
（2）过程：
第（一）步：加热至90～95℃DNA解链；
第（二）步：冷却到55～60℃,引物结合到互补DNA链；
第（三）步：加热至70～75℃,热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成.
第二步：基因表达载体的构建
1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传至下一代,使目的基因能够表达和发挥作用.
2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因
（1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的首端,是RNA聚合酶识别和结合的部位,能驱动基因转录出mRNA,最终获得所需的蛋白质.
（2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的尾端.
（3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来.常用的标记基因是抗生素基因.
第三步：将目的基因导入受体细胞_
1.转化的概念：
是目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程.
2.常用的转化方法：
将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法,其次还有基因枪法和花粉管通道法等.
将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术.此方法的受体细胞多是受精卵.
将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少 ,最常用的原核细胞是大肠杆菌,其转化方法是：先用Ca2+ 处理细胞,使其成为感受态细胞,再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程.
3.重组细胞导入受体细胞后,筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达.
第四步：目的基因的检测和表达
1.首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因,方法是采用DNA分子杂交技术.
2.其次还要检测目的基因是否转录出了mRNA,方法是采用用标记的目的基因作探针与 mRNA杂交.
3.最后检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法是从转基因生物中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原－抗体杂交.
4.有时还需进行个体生物学水平的鉴定.如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状.
“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）
（1）来源：
主要是从原核生物中分离纯化出来的.
（2）功能：
能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开,因此具有专一性.
（3）结果：
经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端.
“分子缝合针”——DNA连接酶
(1)两种DNA连接酶（E•coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较：
①相同点：都缝合磷酸二酯键.
②区别：
E•coliDNA连接酶来源于T4噬菌体,只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端,但连接平末端的之间的效率较低.
(2)与DNA聚合酶作用的异同：
DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端,形成磷酸二酯键.DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端,形成磷酸二酯键.
“分子运输车”——载体
（1）载体具备的条件：
①能在受体细胞中复制并稳定保存.
②具有一至多个限制酶切点,供外源DNA片段插入.
③具有标记基因,供重组DNA的鉴定和选择.
（2）最常用的载体是¬¬质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外,并具有自我复制能力的双链环状DNA分子.
（3）其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒.
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1楼说的是种子的构建，然后还有菌毒种扩大培养，粗纯，精纯，配比，灌装，详细点至少够毕业论文了。。。。。找本生物制药的书看吧。