请问流式细胞仪检测细胞凋亡的原理是什么?请问流式细胞仪检测细胞凋亡是检测什么指标?如何判定细胞凋亡呢?

来源：学生作业帮助网 编辑：作业帮 时间：2024/11/16 14:25:07
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一、原理
在正常细胞中,磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧,而在细胞凋亡早期,细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧.Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力,故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合.因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一.将Annexin V进行荧光素（EGFP、FITC）标记,以标记了的Annexin V作为荧光探针,利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生.
碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但对凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核染红.因此将Annexin V与PI匹配使用,就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来.
二、注意事项
1、必须活细胞检测,不能用能破坏细胞膜完整性的固定剂和穿透剂固定或穿膜.
2、特殊细胞的染色方法：在消化或吹打时,有些细胞（如神经元细胞）很容易受到损伤,导致晚期凋亡或坏死比例非常高,不能反映真实结果.实验的解决方法：先低速离心,吸取细胞培养板中的液体,留少许液体,加入适量PI和Annexin-V染色10min后,将漂浮细胞吸至离心管中,离心洗涤两次,用PBS漂洗贴壁细胞两次,加胰酶消化后将细胞悬液移至另一离心管中,离心洗涤,再与漂浮细胞合并后上流式细胞仪检测.应用该法可降低晚期凋亡和坏死比例,增加早期凋亡细胞比例.
3、由于Annexin-V为钙离子依赖的磷脂结合蛋白,只有在钙离子存在的情况下与PS的亲和力才大,因而在消化细胞时,建议一般不采用含EDTA的消化液.
4、必须设置阴性对照和补偿对照（分别单染）.

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